In der Biotechnologie und industriellen Mikrobiologie,ist die genaue Überwachung der Gesundheit und Menge von Bakterienzellen in Bioreaktorenentscheidend für die Prozessoptimierung und Produktqualität. Traditionell ist die gängigste Methode zur Schätzung der Bakterienkonzentrationdie optische Dichte (OD)Messung, typischerweise bei 600 nm (OD600). Diese Methode hat jedoch erhebliche Einschränkungen, insbesondere beim Unterscheiden zwischen lebenden und toten Zellen.
Die Einschränkungen der optischen Dichte
Die optische Dichte wird wegen ihrer Schnelligkeit, Kosteneffizienz und einfachen Automatisierbarkeit bevorzugt. Sie misst, wie viel Licht eine Bakteriensuspension absorbiert, was mit der Zellkonzentration korreliert, sobald eine Standardkurve erstellt ist. Allerdingskann die OD nicht zwischen lebenden und toten Zellen unterscheiden— beide tragen gleichermaßen zum Absorptionswert bei. Das bedeutet, dass OD-Messungen die Anzahl der lebensfähigen Bakterien überschätzen können, insbesondere in Kulturen, in denen Zellsterben aufgrund von Stress, Nährstoffmangel oder anderen Faktoren auftritt.
Warum das Unterscheiden von lebenden und toten Zellen wichtig ist
In der Bioprozessierung tragen nur lebende Zellen zur Produktbildung, Substratverbrauch und metabolischen Aktivität bei. Tote Zellen können die nachgelagerte Verarbeitung, Produktreinheit und sogar die Sicherheit beeinträchtigen. Daher ist es entscheidend, eine Methode zu haben, die lebensfähige Bakterien spezifisch quantifiziert, um eine genaue Prozesskontrolle und -optimierung zu gewährleisten.
Andere Methoden zur Überwachung der Biomasse in Bioreaktoren
Neben der OD werden mehrere andere Techniken verwendet, um die Zellkonzentration in Bioreaktoren zu überwachen. Jede hat jedoch im Vergleich zur Durchflusszytometrie erhebliche Einschränkungen:
- Plattenzählung:Diese klassische mikrobiologische Methode misst lebensfähige Zellen, indem sie koloniebildende Einheiten (KBE) nach der Inkubation zählt. Obwohl sie spezifisch für lebende Zellen ist, ist sie äußerst zeitaufwendig (oft 24–48 Stunden), arbeitsintensiv und kann die Zellzahlen aufgrund vonVerklumpungoder der Anwesenheit vonlebensfähigen, aber nicht kultivierbaren Zellen (VBNC).
- Direkte Mikroskopie:Zellen werden visuell unter einem Mikroskop gezählt, manchmal unter Verwendung von Lebensfähigkeit-Färbemitteln. Diese Methode ist mühsam, subjektiv und unpraktisch für die routinemäßige oder hochdurchsatzmäßige Überwachung.
- Trockengewichtsbestimmung:Biomasse wird gefiltert, getrocknet und gewogen. Dies liefert eine genaue Messung der Gesamtbiomasse, ist jedoch langsam, zerstörerisch und kann nicht zwischen lebenden und toten Zellen unterscheiden.
- Konduktometrische und elektrochemische Methoden:Diese messen Änderungen der Leitfähigkeit oder der metabolischen Aktivität im Kulturmedium. Obwohl sie indirekte Informationen über das Zellwachstum liefern können, fehlt ihnen die Spezifität für lebensfähige Zellzahlen und sie werden von anderen Substanzen im Medium beeinflusst.
- Fluoreszierende Proteinexpression:Einige gentechnisch veränderte Stämme exprimieren fluoreszierende Marker, die eine Echtzeitverfolgung ermöglichen. Dies erfordert jedoch genetische Modifikationen und ist nicht auf alle Organismen oder industrielle Prozesse anwendbar.
Zusammenfassend:Alle diese Methoden haben erhebliche Nachteile in Bezug auf Geschwindigkeit, Spezifität oder Praktikabilität für die Echtzeit-Prozesskontrolle.
Durchflusszytometrie: Eine moderne Alternative
Die Durchflusszytometrie hat sich als eine schnelle, reproduzierbare und wirtschaftliche Technik zur Quantifizierung von Bakterienzellen in Bioreaktorkulturen etabliert. In Kombination mit spezifischen Färbeprotokollen kann die Durchflusszytometrie zwischen intakten (lebensfähigen) und beschädigten (nicht lebensfähigen) Zellen unterscheiden – dies wird oft alsIntakte Zellzahl (ICC).
Mitder durchflusszytometriebasierten ICC, werden nur Bakterien mit intakten Membranen (ein Merkmal der Lebensfähigkeit) als "lebendig" gezählt. Dieser Ansatz bietet eine direkte Messung der bakteriellen Gesundheit im Bioreaktor, ermöglicht die Echtzeitüberwachung der Vitalität der Kultur und ermöglicht eine schnelle Reaktion auf Prozessabweichungen.
Vorteile der ICC durch Durchflusszytometrie
- Spezifität:Unterscheidet genau zwischen lebenden und toten Zellen basierend auf der Membranintegrität.
- Geschwindigkeit:Ergebnisse sind bereits nach 30 Minuten für reine Kulturen verfügbar.
- Handlungsrelevante Daten:Ermöglicht eine präzise Kontrolle von Bioprozessen durch Bereitstellung von Echtzeitinformationen zur Lebensfähigkeit.
- Reproduzierbarkeit:Automatisiert und hochdurchsatzfähig, wodurch die Variabilität des Bedieners verringert wird.
- Multiparametrische Daten:Gleichzeitige Messung der Zelllebensfähigkeit, Größe und physiologischen Zustands für tiefere Einblicke in die Gesundheit der Kultur.
Anwendungsbeispiel: Die Lösung von rqmicro
Bei rqmicro nutzen wir die Durchflusszytometrie, um schnelle, zuverlässige ICC-Messungen direkt aus Bioreaktormustern bereitzustellen. In reinen Kulturen (einzelne Bakterienarten) liefert diese Methodehandlungsrelevante Daten zur Konzentration lebensfähiger Zellen innerhalb von 30 Minuten.— weit schneller und informativer als traditionelle Plattenzählungen oder OD-Messungen. Dies ermöglicht es den Betreibern, die Fütterung, Belüftung und Erntezeitpunkte basierend auf dem tatsächlichen Gesundheitszustand ihrer Kulturen zu optimieren.
Fazit
Während die optische Dichte ein nützliches Werkzeug für die routinemäßige Überwachung bleibt, kann sie keine Informationen über die Zellviabilität liefern. Andere Methoden, obwohl verfügbar, sind oft zu langsam, mühsam oder mangelhaft spezifisch für lebende Zellen.Die auf Durchflusszytometrie basierende ICC bietet eine leistungsstarke Alternative, die schnelle, zuverlässige und spezifische Einblicke in die lebende Bakterienpopulation in Bioreaktoren liefert. Für die moderne Bioprozessierung bedeutet dies bessere Kontrolle, höhere Erträge und verbesserte Produktqualität.