在生物技术和工业微生物学中，准确监测生物反应器中细菌细胞的健康状况和数量对于过程优化和产品质量至关重要。传统上，估计细菌浓度最常用的方法是光密度（OD）测量，通常在600 nm（OD600）处进行。然而，这种方法有显著的局限性，特别是在区分活细胞和死细胞时。
光密度的局限性
光密度因其快速、廉价和易于自动化而受到青睐。它测量细菌悬浮液吸收多少光，这与细胞浓度相关，一旦建立了标准曲线。然而，OD无法区分活细胞和死细胞——两者对吸光度值的贡献是相等的。这意味着OD测量可能会高估可存活细菌的数量，特别是在由于压力、营养耗竭或其他因素导致细胞死亡的培养中。
为什么区分活细胞和死细胞很重要
在生物加工中，只有活细胞才能参与产品形成、底物消耗和代谢活动。死细胞可能会影响后续处理、产品纯度甚至安全性。因此，拥有一种专门量化可存活细菌的方法对于准确的过程控制和优化至关重要。
监测生物反应器中生物量的其他方法
除了OD，还有几种其他技术用于监测生物反应器中的细胞浓度。然而，与流式细胞术相比，每种方法都有显著的局限性：
- 平板计数：这种经典的微生物学方法通过在培养后计数形成菌落单位（CFU）来测量活细胞。虽然对活细胞具有特异性，但它非常耗时（通常需要24-48小时）、劳动密集，并且由于聚集或存在可活但不可培养的细胞（VBNC）.
- 直接显微镜观察：在显微镜下对细胞进行目测计数，有时使用活性染料。该方法劳动强度大、主观性强，并且不适合常规或高通量监测。
- 干重测量：生物量经过过滤、干燥和称重。这提供了总生物量的准确测量，但速度慢、破坏性强，无法区分活细胞和死细胞。
- 电导率和电化学方法：这些方法测量培养基中电导率或代谢活动的变化。虽然它们可以提供关于细胞生长的间接信息，但缺乏对活细胞计数的特异性，并受到培养基中其他物质的影响。
- 荧光蛋白表达：一些工程菌株表达荧光标记，允许实时追踪。然而，这需要基因改造，并不适用于所有生物或工业过程。
总结：所有这些方法在速度、特异性或实时过程控制的实用性方面都有显著缺陷。
流式细胞术：一种现代替代方案
流式细胞术已成为一种快速、可重复和经济的技术，用于定量生物反应器培养中的细菌细胞。当与特定的染色协议结合时，流式细胞术可以区分完整（活的）和受损（非活的）细胞——这通常被称为完整细胞计数（ICC）.
通过基于流式细胞术的ICC, 只有具有完整膜（活性标志）的细菌被计为“活的”。这种方法提供了生物反应器中细菌健康的直接测量，允许实时监测培养活力，并能够快速响应过程偏差。
流式细胞术ICC的优势
- 特异性：基于膜完整性准确区分活细胞和死细胞。
- 速度：对于纯培养，结果在30分钟内即可获得。
- 可操作数据：通过提供实时活性信息，实现对生物过程的精确控制。
- 可重复性：自动化和高通量，减少操作人员的变异性。
- 多参数数据：同时测量细胞活性、大小和生理状态，以深入了解培养健康。
应用示例：rqmicro的解决方案
在rqmicro，我们利用流式细胞术直接从生物反应器样本中提供快速、可靠的ICC测量。在纯培养（单一细菌种类）中，这种方法提供了在30分钟内关于活细胞浓度的可操作数据— 比传统的平板计数或光密度测量快得多且信息更丰富。这使操作员能够根据其培养物的真实健康状态优化喂养、通气和收获时机。
结论
虽然光密度仍然是常规监测的有用工具，但它无法提供细胞活力的信息。其他方法虽然可用，但往往太慢、劳动密集，或缺乏对活细胞的特异性。基于流式细胞术的ICC提供了一种强有力的替代方案，快速、可靠且特异性地提供生物反应器中活细菌群体的洞察。对于现代生物加工，这意味着更好的控制、更高的产量和更好的产品质量。