En biotechnologie et microbiologie industrielle,surveiller avec précision la santé et la quantité de cellules bactériennes dans les bioréacteursest crucial pour l'optimisation des processus et la qualité des produits. Traditionnellement, la méthode la plus courante pour estimer la concentration bactérienne estla densité optique (DO)mesurée, généralement à 600 nm (DO600). Cependant, cette méthode présente des limitations significatives, notamment lorsqu'il s'agit de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.
Les limitations de la densité optique
La densité optique est privilégiée pour sa rapidité, son faible coût et sa facilité d'automatisation. Elle mesure la quantité de lumière absorbée par une suspension bactérienne, ce qui est corrélé à la concentration cellulaire une fois qu'une courbe standard est établie. Cependant,la DO ne peut pas différencier les cellules vivantes des cellules mortes— les deux contribuent également à la valeur d'absorbance. Cela signifie que les mesures de DO peuvent surestimer le nombre de bactéries viables, en particulier dans les cultures où la mort cellulaire se produit en raison du stress, de l'épuisement des nutriments ou d'autres facteurs.
Pourquoi il est important de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes
Dans le bioprocédés, seules les cellules vivantes contribuent à la formation de produits, à la consommation de substrats et à l'activité métabolique. Les cellules mortes peuvent affecter le traitement en aval, la pureté des produits et même la sécurité. Par conséquent, avoir une méthode qui quantifie spécifiquement les bactéries viables est essentiel pour un contrôle et une optimisation précis des processus.
Autres méthodes pour surveiller la biomasse dans les bioréacteurs
En plus de l'OD, plusieurs autres techniques sont utilisées pour surveiller la concentration cellulaire dans les bioréacteurs. Cependant, chacune présente des limitations significatives par rapport à la cytométrie en flux :
- Comptage sur plaque :Cette méthode microbiologique classique mesure les cellules viables en comptant les unités formant des colonies (UFC) après incubation. Bien qu'elle soit spécifique aux cellules vivantes, elle est extrêmement chronophage (souvent 24 à 48 heures), nécessite beaucoup de main-d'œuvre et peut sous-estimer le nombre de cellules en raison del'agglutinationou de la présence decellules viables mais non cultivables (VBNC).
- Microscopie directe :Les cellules sont comptées visuellement sous un microscope, parfois en utilisant des colorants de viabilité. Cette méthode est laborieuse, subjective et impraticable pour un suivi de routine ou à haut débit.
- Mesure du poids sec :La biomasse est filtrée, séchée et pesée. Cela fournit une mesure précise de la biomasse totale mais est lent, destructeur et ne peut pas distinguer entre les cellules vivantes et mortes.
- Méthodes conductimétriques et électrochimiques :Celles-ci mesurent les changements de conductivité ou d'activité métabolique dans le milieu de culture. Bien qu'elles puissent fournir des informations indirectes sur la croissance cellulaire, elles manquent de spécificité pour les comptages de cellules viables et sont influencées par d'autres substances dans le milieu.
- Expression de protéines fluorescentes :Certaines souches génétiquement modifiées expriment des marqueurs fluorescents, permettant un suivi en temps réel. Cependant, cela nécessite une modification génétique et n'est pas applicable à tous les organismes ou processus industriels.
En résumé :Toutes ces méthodes présentent des inconvénients significatifs en termes de rapidité, de spécificité ou de praticité pour le contrôle des processus en temps réel.
Cytométrie en flux : Une alternative moderne
La cytométrie en flux a émergé comme une technique rapide, reproductible et économique pour quantifier les cellules bactériennes dans les cultures de bioréacteurs. Lorsqu'elle est combinée avec des protocoles de coloration spécifiques, la cytométrie en flux peut distinguer les cellules intactes (viables) des cellules endommagées (non viables) — cela est souvent appeléNombre de cellules intactes (CCI).
Avecle CCI basé sur la cytométrie en flux, seules les bactéries avec des membranes intactes (un signe de viabilité) sont comptées comme "vivantes". Cette approche fournit une mesure directe de la santé bactérienne dans le bioréacteur, permettant une surveillance en temps réel de la vitalité de la culture et permettant une réponse rapide aux écarts de processus.
Avantages du CCI par cytométrie en flux
- Spécificité :Distinction précise entre les cellules vivantes et mortes basée sur l'intégrité de la membrane.
- Vitesse :Les résultats sont disponibles en aussi peu que 30 minutes pour des cultures pures.
- Données exploitables :Permet un contrôle précis des bioprocédés en fournissant des informations de viabilité en temps réel.
- Reproductibilité :Automatisé et à haut débit, réduisant la variabilité de l'opérateur.
- Données multiparamétriques :Mesure simultanée de la viabilité cellulaire, de la taille et de l'état physiologique pour une meilleure compréhension de la santé de la culture.
Exemple d'application : Solution de rqmicro
Chez rqmicro, nous utilisons la cytométrie en flux pour fournir des mesures CCI rapides et fiables directement à partir d'échantillons de bioréacteur. Dans des cultures pures (espèces bactériennes uniques), cette méthode fournitdes données exploitables sur la concentration de cellules viables en 30 minutes— bien plus rapide et informatif que les comptages de plaques traditionnels ou les mesures de densité optique. Cela permet aux opérateurs d'optimiser l'alimentation, l'aération et le moment de la récolte en fonction de l'état de santé réel de leurs cultures.
Conclusion
Bien que la densité optique reste un outil utile pour le suivi de routine, elle ne peut pas fournir d'informations sur la viabilité cellulaire. D'autres méthodes, bien que disponibles, sont souvent trop lentes, laborieuses ou manquent de spécificité pour les cellules vivantes.L'ICC basée sur la cytométrie en flux offre une alternative puissante, fournissant des informations rapides, fiables et spécifiques sur la population bactérienne vivante dans les bioréacteurs. Pour le bioprocédés moderne, cela signifie un meilleur contrôle, des rendements plus élevés et une qualité de produit améliorée.