Die Kontrolle der Wasser-Mikrobiologie erfordert relevante und genaue Daten. Dieser Artikel bietet einen Überblick über mikrobiologische Nachweismethoden und einen tiefen Einblick in zwei schnelle Methoden zur Quantifizierung lebensfähiger Bakterien: denAdenosintriphosphat (ATP)-Testunddie intakte Zellzahl (ICC).
Die Relevanz von mikrobiologischen Tests
Branchen, die so vielfältig sind wie Lebensmittel & Getränke (F&B), Halbleiter und Automobilproduktion, verwenden große Mengen Wasser für verschiedene Zwecke und teilen eine gemeinsame Quelle von Risiken und Kosten, nämlich wassergebundene Bakterien. Etwa 25 % des weltweiten Lebensmittelverlusts werden durch mikrobiologische Verderbnis verursacht [1]. Bakterien können nicht nur potenziellen Schaden für Endprodukte verursachen, sondern auch für Mitarbeiter, Ausrüstung und Infrastruktur. Zum Beispiel, mikrobiologisch beeinflusste Korrosion (MIC)führt zu erheblichen Vermögensverlusten und ungeplanten Wartungen, insbesondere in der Öl- und Gasindustrie. Unternehmen, die mikrobiologisch steriles Wasser in ihren Produktionsprozessen benötigen, haben hohe Energie- und Wartungskosten durch umfangreiche Wasserrecycling-Systeme.
Daherbenötigen viele Branchen die Erkennung und Quantifizierung der gesamten mikrobiologischen Belastungsowie spezifischer Bakterien, um Kosten und Risiken von Betriebsunterbrechungen zu reduzieren.
Lösungen zur Quantifizierung von Bakterien im Wasser
Der Markt für industrielle Mikrobiologie bietet zahlreiche Produkte zur Quantifizierung lebensfähiger (d.h. lebender) Bakterien, die letztendlich auf nur wenigen relevanten mikrobiologischen Methoden basieren.
Zum einen dieklassische Anbaumethodedie die Tatsache nutzt, dass selbst eine lebensfähige Bakterienzelle zu einer Kolonie von Millionen von Zellen heranwachsen kann, die dann gesehen und gezählt werden können.
Verschiedeneenzym-substratbasierte Methodenverwenden biochemische Reaktionen mit Zellkomponenten, um ein Lichtsignal zu erzeugen. Die Helligkeit einer enzymatischen Reaktion mitAdenosintriphosphat (ATP)zu messen, ist eine gängige Praxis, die in diesem Blogbeitrag weiter erläutert wird.
Im Gegensatz zu Anbau- und enzym-substratbasierten Methoden,ist die Durchflusszytometrie eine optische Messmethode, die direkt lebensfähige Bakterien zähltindem sie Fluoreszenzsignale analysiert und zählt, die von der Oberfläche und von der DNA von Zellen stammen, die mit Farbstoffen gefärbt wurden, die unterschiedliche Farben emittieren. Ein Signal entspricht einer Bakterienzelle, was eine Einzelzellzählung ermöglicht.
Verwendung von ATP zur Bewertung der mikrobiellen Belastung
ATP ist der Treibstoff aller lebenden Zellen und somit das grundlegende Energiemolekül für alle zellulären Prozesse. Jede lebende Zelle enthält intrazelluläres ATP [2], [3], das für die Regulierung der gespeicherten Energie, die Funktionalität von Enzymen und für die Biosynthese erforderlich ist [2].
Die traditionelle Anbaumethode für mikrobiologische Analysen ist langsam und hat eine geringe Sensitivität, da nur ein Bruchteil der Zellen Kolonien bilden kann [2]. Die Messung von ATP hängt nicht vom Bakterienwachstum ab und wird häufig verwendet, um die Wirksamkeit von Reinigungsmaßnahmen und zur Hygieneüberwachung zu überprüfen. Das Auffinden von ATP auf Oberflächen dient als Indikator für unzureichende Reinigung und Kontaminanten wie Bakterien [4]. Während ATP-Tests schnell, einfach zu verwenden und kostengünstig sind [4], sind sie möglicherweise nicht empfindlich genug [3].
Lösungen, die die Menge an Bakterien durch Quantifizierung von intrazellulärem ATP schätzen, gehen wie folgt vor:
- Messen Sie freies (extrazelluläres) ATPdurch das Lichtsignal, das von einem Enzym erzeugt wird, das mit dem ATP reagiert. Je heller das Lichtsignal, desto mehr ATP ist vorhanden.
- Messen Sie das gesamte ATP (intra- und extrazellulär), nachdem die Zellen in der Probe gestört wurden, um das im Inneren der Zellen vorhandene ATP (intrazelluläres ATP) freizusetzen.
- Subtrahieren Sie (1) von (2), um zum intrazellulären ATP zu gelangen. Schätzen Sie dann die Anzahl der im Sample vorhandenen Bakterien basierend auf dem berechneten Wert für intrazelluläres ATP.
Der Unterschied zwischen ATP und der Anzahl der lebensfähigen Bakterien
Nicht intakte oder
nicht lebensfähige Zellen können kein ATP erzeugen, was intrazelluläres ATP geeignet macht, um die Menge an lebensfähigen Zellen anzuzeigen [2].
Obwohl
lineare Beziehungen zwischen intrazellulärem ATP und koloniebildenden Einheiten (CFU)
entdeckt wurden, variiert die ATP-Konzentration pro Zelle zwischen Bakterienarten und sogar von Zelle zu Zelle innerhalb derselben Art [2]. Die Ableitung von Bakterienzellkonzentrationen aus ATP-Konzentrationen bleibt herausfordernd, teilweise aufgrund der Tatsache, dass die ATP-Konzentrationen nicht einheitlich über Bakterienzellen verteilt sind [3]. Eine Erklärung dafür ist, dass der physiologische Zustand einer bestimmten Zelle die Konzentration ihrer Energiewährung, also ATP, beeinflussen kann [3].
Die ATP-Konzentration in Mikroorganismen variiert daher je nach Art, Zellgröße und Stoffwechselzustand, wobei beispielsweise Sporen weniger ATP haben [4]. Daher wurden widersprüchliche Korrelationen zwischen lebensfähigen Bakterienzahlen und ATP-Konzentrationen gefunden [4].
Eine Reihe von kontrollierten Studien hat zudem schwache Präzision und Reproduzierbarkeit sowie inakzeptabel große Variabilität in den Ergebnissen von ATP-Tests aufgezeigt [5]. Darüber hinaus fanden Wissenschaftler am Food Industry Centre, Cardiff Metropolitan University heraus, dass einige ATP-Testgeräte stark von der Betriebstemperatur abhängen könnten. Sie entdeckten außerdem, dass die Zeit von der Aktivierung des Geräts bis zur Signalübertragung die Qualität der Ergebnisse beeinflussen könnte.
Einzelzellzählung mit ICC
Bereiche der Hygieneüberwachung, Qualitätskontrolle in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie sowie Forschungsanwendungen erfordern eine genaue Quantifizierung von Mikroben im Wasser, einschließlich ihrer Lebensfähigkeitsbestimmung [3].
Die flusszytometrische Quantifizierung lebensfähiger Zellen basiert auf der direkten Färbung von Zelloberflächen und DNA, die dann ein Fluoreszenzsignal emittieren, das innerhalb eines Flusszytometers analysiert wird. Durch diese direkte Quantifizierung der in einer Probe vorhandenen Zellen sind die Ergebnisse direkt mit der Anwesenheit ganzer Zellen verbunden und unabhängig vom Zustand und der Größe der Zellen. Im Vergleich zur traditionellen Methode sind die Ergebnisse auch unabhängig vom Bakterienwachstum. Daher liefert die bakterielle Detektion mit Flusszytometrie ein quantitatives und genaues Ergebnis, wodurch das Risiko verringert wird, eine inaktive Zellpopulation zu übersehen, die möglicherweise eine Kontamination verursachen könnte.
Durchführung von ICC-Tests mit rqmicro.COUNT
Die auf Flusszytometrie basierende Technologie von rqmicro ermöglicht es Ihnen, bakterielle Zellen, einschließlich VBNC, in weniger als einer Stunde schnell und genau zu quantifizieren und das zu den gleichen Kosten wie ATP-Tests. Mit dem tragbaren rqmicro.COUNT-Gerät, Sie erhalten zuverlässige Ergebnisse über die mikrobielle Belastung Ihres Wassers an kritischen Kontrollpunkten, wodurch Qualitätskontrollmaßnahmen erleichtert werden. Neben der intakten (lebensfähigen) und der Gesamtzahl (lebensfähig + tot) der Zellen kann die rqmicro-Methode spezifische Krankheitserreger (Escherichia coli, Legionella) mit Hilfe der entsprechenden Testkits nachweisen. ATP-Messungen hingegen erlauben keine spezifische Erkennung und Quantifizierung.
Als zuverlässiges Werkzeug, das relevante Einblicke in Ihr Wassersystem bietet, ermöglicht rqmicro.COUNT eine schnelle Bewertung der Wirksamkeit von Reinigungsmaßnahmen. Folglich wird rqmicro.COUNT die Hygieneüberwachung vorantreiben und Sie dabei unterstützen, Wasser und Endprodukte sicher zu halten.
Referenzen:
[1] Papkovsky, Dmitri B., und Joseph P. Kerry. "Sauerstoffsensor-basierte Respirometrie und die Landschaft der mikrobiellen Testmethoden, die auf Lebensmittel- und Getränkematrizen anwendbar sind."Sensoren23.9 (2023): 4519.
[2] Bottari, Benedetta, Marcela Santarelli und Erasmo Neviani. "Bestimmung der mikrobiellen Belastung für verschiedene Getränke und Lebensmittel durch die Bewertung von intrazellulärem ATP."Trends in der Lebensmittelwissenschaft & Technologie44.1 (2015): 36-48.
[3] Hammes, Frederik et al. "Messung und Interpretation von mikrobiellem Adenosintri-phosphat (ATP) in aquatischen Umgebungen."Wasserforschung44.13 (2010): 3915-3923.
[4] Bakke, Mikio. "Eine umfassende Analyse von ATP-Tests: praktische Anwendung und aktuelle Fortschritte im Gesamta-denylat-Test zur effektiven Überwachung der Hygiene."Zeitschrift für Lebensmittelhygiene85.7 (2022): 1079-1095.
[5] Whiteley, Greg S., et al. "Das ewige Problem der Variabilität bei Adenosintriphosphat (ATP)-Tests zur Hygieneüberwachung in Gesundheitseinrichtungen."Infektionskontrolle & Krankenhaus-Epidemiologie36.6 (2015): 658-663.
[6] Sousi, Mohaned, et al. "Vergleich des bakteriellen Wachstumspotenzials von ultranährstoffarmem Trinkwasser, bewertet durch Wachstumstests basierend auf der Durchflusszytometrie der intakten Zellzahl im Vergleich zu Adenosintriphosphat."Wasserforschung203 (2021): 117506.
[7] Kong, Xiujuan, et al. "Erhebliche Abweichungen zwischen HPC-, ATP- und FCM-Nachweismethoden bei der Bewertung der Desinfektionseffizienz von grampositiven und gramnegativen Bakterien durch ultraviolette Strahlung und Chlorierung."Entsalzung und Wasseraufbereitung57.37 (2016): 17537-17546.