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Das rqmicro Testverfahren

  • Der Arbeitsablauf schematisch dargestellt:
  • Filtration einer Wasserprobe mit einer Standard-Filtrationseinheit über einen Polycarbonat-Filter mit einer Porengrösse von 0.22 μm, mitgeliefert im Kit. Der Filter wird in einem Probevolumen von 3 mL Puffer resuspendiert. Die bakteriellen Zellen werden mit diesem allgemein üblichen Schritt, der auch Teil der Standardmethode ist, aufkonzentriert.
  • Der Probe werden nun spezifische Antikörper, die an magnetische Partikel gebunden sind, sowie spezifische Antikörper, die an einen Fluoreszenz-Farbstoff gebunden sind, zugegeben. Die Antikörper, die an die magnetischen Partikel gebunden sind, ermöglichen es, die Zielzellen mithilfe der sogenannten immunomagnetischen Separation vom Rest der Probe zu trennen. Die an einen Fluoreszenz-Farbstoff gebundenen Antikörper erlauben die Quantifizierung der bakteriellen Zellen nach der immunomagnetischen Separation in einem Durchflusszytometer.
  • Die Probe wird dann für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, so dass die Antikörper an die Zielzellen binden können.
  • Während der Separation, die im CellStream oder in Manueller immunomagnetischen Separator (MIMS) stattfindet, werden die bakteriellen Zielzellen, z.B. Legionellen, in einem Volumen von 1 mL gesammelt und somit noch einmal aufkonzentriert. In dieser positiven Fraktion befinden sich die Zielzellen in sauberem Puffer. Mit dem rqmicro Tesverfahren wird eine Probenreinheit von >95 % erreicht.
  • Die positive Fraktion kann dann mit einem handelsüblichen Durchflusszytometer gemessen und quantifiziert werden. Die Probe kann aber auch mittels PCR, durch Plattierung und Kultivierung von Bakterienzellen (Standardmethode), Fluoreszenzmikroskopie etc. analysiert
  • Antikörper sind Bindeproteine, die ein spezifisches Epitop (molekulare Struktur, Antigen) erkennen und daran binden. Die Antikörper, die rqmicro verwendet, wurden so ausgewählt, dass sie spezifische Epitope auf der Oberfläche von Legionellen erkennen.
  • Antikörper werden von B-Zellen des Immunsystems hergestellt und sekretiert. Jede B-Zelle (Gruppe von B-Zellen) stellt einen bestimmten Antikörper her. Jeder Antikörper besitzt eine spezifische, für ihn charakteristische Antigenbindungsstelle.
  • Trinkwasser, Oberflächenwässer, Kühlturmwasser, Abwasser, Umweltwasser, Industriewasser
  • rqmicro arbeitet daran, dass auch Lebensmittelproben mit dem Testverfahren analysiert werden können. Die Probenvorbereitung muss angepasst werden.
  • Da die Proben innerhalb eines Tages analysiert werden können, ist die rqmicro Methode besonders interessant, um bei einem Ausbruch der Legionärskrankheit die Kontaminationsquelle sofort identifizieren zu können. Auch ein Desinfektionsprozess kann mittels dem schnellem Testverfahren von rqmicro überwacht und allenfalls optimiert werden.
  • Die Probenaufbereitung ist hochspezifisch. Die Spezifität kommt durch den Einsatz von monoklonalen Antikörpern zustande, welche einzig an die bakteriellen Zielzellen, z.B Legionella pneumophila SG1 im aktuellen Kit, binden.
  • rqmicros Antikörperentwicklungsteam produziert und prüft proprietäre Antikörper, welche dann für die Magnetseparation an magnetische Partikel gebunden werden.
  • Das Detektionslimit ist abhängig vom Analysegerät, in unserem Fall einem Durchflusszytometer (Carry-Over, Sauberkeit, etc.). und von der Matrix
  • Unteres Detektionslimit: 20 – 50 bakterielle Zellen / Liter
  • Oberes Detektionslimit in Trinkwasser: zwischen 10^8 und 10^9 bakterielle Zellen. Es besteht immer die Option weniger Probe zu filtrieren wenn die Zellzahl extrem hoch ist.
  • Möchte man im gleichen Punktediagramm (Plot) zwei unterschiedliche Populationen identifizieren können, beispielsweise lebende und tote Legionellen, müssen diese mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoffen angefärbt sein.
  • Der Viabilitätsfarbstoff ist rot und kann nur tote Zellen anfärben. Der andere Farbstoff, der alle in einer Probe vorhandenen Zielzellen anfärbt, ist grün. Dadurch werden die abgestorbenen Zellen rot und grün gefärbt, während die lebensfähigen Zellen nur grün gefärbt werden. Auf diese Weise können bei der Analyse mit dem Durchflusszytometer die lebensfähige und die tote Zellpopulation leicht unterschieden werden.

Punktdiagramme sind eine Möglichkeit, das Resultat einer Messung mit dem Durchflusszytometer darzustellen. Auf dem linken Diagramm sind die alle in der Probe vorhandenen Legionellen mit dem Farbstoff grün angefärbt. Indem ein Fenster um die Legionellen-Population gesetzt wird (englisch gaten; ein Gate setzten), kann die Zellzahl ermittelt werden. Auf dem rechten Diagramm wurde der Probe der Viabilitätsfarbstoff zugegeben, der die toten Zellen rot anfärbt. Die toten Legionellen sind dann sowohl grün, als auch rot angefärbt und verschieben sich (shiften) im Gegensatz zum linken Diagramm nach oben.

Die Partikel sedimentieren relativ schnell, im Bereich von Minuten.

Die bakteriellen Zellen können nach der IMS wieder kultiviert werden.

Nach der Separation und Aufkonzentration mit dem rqmicro Kit und dem CellStream, kann die Positivfraktion neben dem Durchflusszytometer auch für verschiedene andere Analysemethoden verwendet werden z.B. PCR, Plattierung, ATP, etc.

Für das bestmögliche Ergebnis empfehlen wie die Positivfraktion sofort nach der Separation weiterzuverarbeiten. Die Lagerbedingungen der aufbereiteten Positivfraktion richten sich in diesem Fall nach dem weiteren Verwendungszweck. Soll die Probe auf Agarplatten ausgestrichen werden, kann sie bei Raumtemperatur für einige Stunden gelagert werden, andernfalls empfehlen wir, die Proben im Kühlschrank aufzubewahren.

z.B. Während des Einsatzes des CellStream oder auch während der Inkubation kann die Filtration der Proben durchgeführt werden.

  • Der Arbeitsablauf ist signifikant kürzer (Zeiteinsparung)
  • Die FCM-Methode liefert spezifischere Ergebnisse, indem sie zwischen lebenden und toten Zellen unterschieden kann
  • Es ist keine Anreicherung nötig
  • Das Risiko „falsch-negativer“ Ergebnisse ist mit der Methode von rqmicro signifikant tiefer
  • Das kommerzielle Kit ist für Legionella pneumophila SG1
  • L.p. SG1-15 und L. spp. werden im Verlauf von 2018 auf den Markt kommen.
  • rqmicro arbeitet daran weitere spezifische Antikörpern und Tests zu entwickeln und auf den Markt zu bringen. Die nächsten Kits werden voraussichtlich für Pseudomonas aeruginoasa, Colibakterien, Giardia, Cryptosporidium und Salmonellen sein.
  • Das rqmicro Testverfahren wurde intern validiert. Kunden profitieren seit 3 Jahren vom internen Laborservice.
  • Eine AOAC und ISO Zertifizierung ist geplant, sowie Ringversuche, um die Korrelation zur ISO-Methode zu verifizieren (in verschiedenen Matrizen).
  • Das Kit für Legionella pneumophila SG1 haben wurde intern validiert. Sobald die anderen Kits verfügbar sind werden diese ebenfalls intern validiert und anschliessend werden Ringversuche durchgeführt.

Legionellendetektion und rqmicro Testverfahren

  • Filtration: 5 – 30 / Probe min (hängt vom Volumen ab, das filtriert werden muss und davon, wie stark verschmutzt die Probe ist)
  • Handling: 5 min / Probe (vortexten, transferieren, Zugabe von Reagenzien)
  • Inkubation: 30 min
  • Separation: 35 min. – es können 4 Proben parallel im CellStream verarbeitet werden
  • Detektion: ca. 1 min / Probe (mit Durchflusszytometrie)
  • 60 – 90 Minuten, 120 Minuten maximal
Komponente Beschreibung Menge Reaktionen
Filter Polycarbonatfilter; Porengrösse 0.22 µm; Ø 47 mm 100 96
Puffer 1 Waschpuffer 300 mL 96
Puffer 2 Auftrennungspuffer 300 mL 96
Magnetische Partikel Magnetische Partikel, die an monoklonale Antikörper gebunden sind 3 mL 96
Farbstoff Antikörper zur Färbung von Legionella pneumophila SG1-Zellen; Ex/Em 493/518 nm 1 Röhrchen* 96
Viabilitäts-Farbstoff Propidiumiodid; durchdringt Membran toter Zellen und färbt DNA; Ex/Em 535/617 nm 1 mL 96
Positivkontrolle Lyophilisat; chemisch fixierte, gefriergetrocknete, Legionella pneumophila Philadelphia-Zellen 1 Röhrchen** 10

* Vor Gebrauch für 2 min bei maximaler Stärke zentrifugieren. **Vor der ersten Anwendung: 1 mL Puffer 1 in das Röhrchen pipettieren und vortexen bis das Lyophilisat vollständig gelöst ist. Diese Stammlösung kann bei 2 – 8 °C aufbewahrt werden.

  • 25 mikrofluidische Kartuschen (4 Probencontainer; ergibt 96 Reaktionen)
  • Die Resultate korrelieren (siehe Broschüre) mit 5-10 Mal höherer Sensitivität beim rqmicro Testverfahren.
  • Die höhere Sensitivität kommt unter anderem Zustande, da die Standardmethode nur jene Zielzellen erfasst, die auf Agarplatten wachsen. Je nach Probe sind dies zwischen 5% und 10% der tatsächlich vorhanden Zellen. rqmicro arbeitet mit Durchflusszytometrie, einem Analyseverfahren, dass kultivierungsunabhängig ist und alle bakteriellen Zielzellen erfasst.
  • Die Methode von rqmicro detektiert auch VBNC (viable but non-culturable) Zellen. Diese können infektiös sein, bzw. unter Umständen wieder infektiös werden, wachsen jedoch auf der Platte nicht und werden daher durch die Standardmethode nicht nachgewiesen.
  • Mehr als 95% der ursprünglich in der Probe vorhandenen und in der positiven Fraktion nicht erwünschten Begleitflora, werden durch das Verfahren von rqmicro eliminiert. Dies macht die sonst üblichen Hitze- und Säurebehandlungen obsolet, die für die Legionellen potenziell schädlich sind und ihr Wachstum auf Agar hemmen oder ganz verunmöglichen. Die Standardmethode liefert auch aus diesem Grund häufig falsch-negative oder deutliche zu tiefe Resultate, wenn es um die Zellzahlbestimmung von Legionellen geht. Bakterielle Zellen, die mit IMS aufgereinigt und isoliert wurden, sind hingegen unbeschädigt und wachsen gut auf Agarplatten.

Um bei der Resuspendierung des Filters das bestmöglichste Ergebnis zu erhalten verwendet rqmicro abgeschliffene Polycarbonatfilter – das herausgefilterte Material löst sich besser von der Oberfläche.

  • Mehr als 95% der ursprünglich in der Probe vorhandenen und in der positiven Fraktion nicht erwünschten Begleitflora, werden durch das rqmicro-Verfahren eliminiert. Dies macht die sonst üblichen Hitze- und Säurebehandlungen obsolet, die für die Legionellen potenziell schädlich sind und ihr Wachstum auf Agar hemmen oder ganz verunmöglichen. Die Standardmethode liefert auch aus diesem Grund häufig falsch-negative oder deutliche zu tiefe Resultate, wenn es um die Zellzahlbestimmung von Legionellen geht. Bakterielle Zellen, die mit IMS aufgereinigt und isoliert wurden, sind hingegen unbeschädigt und wachsen gut auf Agarplatten.
  • Die relative Abwesenheit von Begleitflora ist ein weiterer Vorteil der rqmicro-Methode, da hohe Zellzahlen anderer Bakterien das Wachstum von Legionellen unterdrücken können.

CellStream Instrument

  • Während der Separation, die im CellStream in einer mikrofluidischen Kartusche stattfindet, wird das Sample durch einen schmalen Kanal von links nach rechts transportiert. Dies geschieht indem mit einer Vakuumpumpe ein Über- bzw. Unterdruck in den entsprechenden Behältern der Kartusche aufgebaut wird. Während diesem Vorgang wird ein Magnet heruntergefahren, der diejenigen bakteriellen Zellen, die über spezifische Antikörper an magnetische Partikel gebunden sind, am Weiterfliessen im Kanal hindert (Immobilisierung). Somit sind die Zielzellen immobilisiert und gleichzeitig gelangen > 95% der in der Probe ursprünglich vorhandenen, nicht erwünschten Begleitflora, in die Restfraktion (Waste). Darauf folgt ein Waschschritt mit Puffer, der zur hohen Probenreinheit beiträgt.
  • Im letzten Schritt der Separation wird der Magnet hochgefahren und die Zielzellen werden zusammen mit Puffer in den Behälter der positiven Fraktion geleitet.
  • Die aufkonzentrierten Zielzellen, die Positivfraktion, befinden sich am Ende des Prozesses in 1 mL sauberem Puffer.

Die immunomagnetische Separation passiert auf der mikrofluidischen Kartusche im CellStream-Gerät.

In einem Arbeitstag (7 Stunden) können von einer Person ca. 44-48 Proben verarbeitet werden (12‘240 Proben/Jahr).

Es ist keine Temperatur-Regelung im CellStream Gerät nötig. Die im Gerät installierten Komponenten werden während der Probeaufbereitung nicht erwärmt.

Wir empfehlen pro Jahr eine Wartung bei rqmicro AG oder einem Distributionspartner durchzuführen.

Folgende Baugruppen des Gerätes sind im Vertrag eingeschlossen:

  1. Gehäuse
  2. Mechanik
  3. Aktuation/Pneumatik
  4. Elektronik inkl. Bildschirm, Anschlüsse

Leistungsumfang:

  1. Zwei vorbeugende Wartungen des Gerätes
  2. Bei Bedarf unbegrenzte Anzahl von Reparatureinsätzen

Die schwarze Gummidichtung an der Decke der Kartuschenkammer muss vor der ersten Anwendung gereinigt werden und danach ca. einmal pro Woche. Dazu eine Mischung aus 70 % Ethanol in Wasser verwenden.

Es wird empfohlen die Positivfraktion nach Ende des Prozesses so schnell wie möglich der Kartusche zu entnehmen um Rückfluss zu vermeiden. Am Ende des Prozesses entstehen ausserdem Luftbläschen im Kanal zu Positivfraktion, was die Gefahr des Rückflusses vermindert.

Durchflusszytometrie

Da 95% der in einer Probe befindlichen Begleitflora durch den CellStream entfernt wird, ist die Positivfraktion sauber und das Hintergrundrauschen tief. Die Zielzellen befinden sich in sauberem Puffer, wenn sie mit dem Durchflusszytometer analysiert werden. Je höher die anfängliche Zellzahl der Begleitflora in einer bestimmten Probe ist, desto höher ist die Anzahl der Begleitflora, die in der positiven Fraktion landen. Ein höheres Hintergrundrauschen im Vergleich zu Trinkwasser ist typisch für komplexe Matrizen z.B. aus Kühltürmen.

  • Die Analyse kann mit jedem handelsüblichen Durchflusszytometer durchgeführt werden
  • rqmicro empfiehlt folgende Geräte: Attune (Thermo Fisher Scientific), Cytoflex (Beckman Coulter) und Accuri (Becton Dickinson).
  • Die Probenmatrix hat insofern einen Einfluss auf das Resultat der Durchflusszytometrie, als dass sie den Zustand der bakteriellen Zellen beeinflusst: Sind viele Nährstoffe vorhanden, dann sind die Zellen möglicherweise grösser (kommt auch noch auf die Temperatur, die Konkurrenz etc. an) und ihre metabolische Aktivität ist höher, wenn die Zellen am Wachsen und sich Teilen sind. Die Life Scientist Spezialisten von rqmicro helfen gerne dabei, die Punktdiagramme richtig zu interpretieren. In der Folge ist dies mit ein wenig Erfahrung problemlos möglich.
  • Bei der immunomagnetischen Separation durch den CellStream werden die bakteriellen Zielzellen von der übrigen Probe getrennt und in sauberem Puffer gesammelt (Volumen 1 mL). Mehr als 95% der ursprünglich in der Probe vorhandenen und in der positiven Fraktion nicht erwünschten Begleitflora, landen in der Restfraktion (Waste). In gewöhnlichem Trinkwasser findet man in der Regel etwa 60 bis 80 Mio. Zellen pro Liter, während z.B. in Kühlturmwasser die Zellzahl in der Regel deutlich höher ist. Je höher die anfängliche Zellzahl der Begleitflora in einer bestimmten Probe ist, desto höher ist die Anzahl der Begleitflora, die in der positiven Fraktion landen. Ein höheres Hintergrundrauschen im Vergleich zu Trinkwasser ist typisch für komplexe Matrizen z.B. aus Kühltürmen.

Mindestens Detektoren im grünen und roten Wellenlängenbereich.

  1. Grünfluoreszenz: Ex/Em 493/518 nm
  2. Rotfluoreszenz: Ex/Em 535/617 nm
  3. Setzen von individuelle Gates

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